Quy trình nuôi cấy sinh khối rễ tơ Ké hoa đào được thiết lập với 2 mô hình là nuôi cấy in vitro và nuôi cấy thủy canh. Các quy trình này nhằm thu nhận nguyên liệu có hoạt tính sinh học cao để sản xuất hoạt chất điều trị tiểu đường tuýp 2.
Tình hình sản xuất và tiêu thụ
Cây Ké hoa đào được biết đến trong dân gian Việt Nam như là một vị thuốc điều trị bệnh. Những năm gần đây, trên thế giới đã có những nghiên cứu về khả năng điều trị bệnh tiểu đường của cây. Các kết quả khảo sát cho thấy rễ là bộ phận có hoạt tính cao nhất.
Cây Ké hoa đào ngoài tự nhiên
Bệnh tiểu đường hiện là mối quan tâm hàng đầu của ngành y tế không riêng ở Việt Nam mà còn trên toàn thế giới. Với mức độ gia tăng của bệnh tiểu đường, các biến chứng, khả năng điều trị bệnh được ghi nhận, việc tìm ra nguyên liệu có khả năng thu nhận hoạt chất tinh khiết đặc trị tiểu đường sẽ là một bước tiến quan trọng đáp ứng được nhu cầu của ngành y tế hiện nay.
Để sản xuất được thuốc có giá thành hạ, ngoài việc phát triển về công nghệ bào chế và tinh chế thuốc thì việc cung cấp nguồn nguyên liệu chất lượng và ổn định cũng là yếu tố quan trọng.
Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của rễ Ké hoa đào và các dược chất có khả năng điều trị bệnh tiểu đường tuýp 2 cho thấy, rễ Ké hoa đào có tiềm năng ứng dụng để điều trị tiểu đường tuýp 2 rất cao. Việt Nam mỗi năm tiêu tốn hàng ngàn tỷ đồng để nhập khẩu các loại thuốc điều trị tốn kém. Trong khi đó, các kỹ thuật canh tác cây dược liệu như thủy canh, bán thủy canh hay khí canh là những bước tiến mới trong nông nghiệp đã được các nước phát triển trên thế giới áp dụng nhằm thu nhận nguồn rễ dược liệu sạch, an toàn, hoạt tính cao với quy mô lớn.
Tại Việt Nam, Doanh nghiệp tư nhân trà Hoàn Ngọc Bảy Nga (Tây Ninh) cho biết các nhà khoa học đã nghiên cứu và xác định rễ của cây Hoàn ngọc (Pseuderanthemum palatiferum) bảy năm tuổi có thể tiêu diệt tế bào ung thư tuyến tụy, tiền liệt tuyến, cổ, đầu, da và tăng cường hệ miễn dịch. Nhờ kết quả nghiên cứu này, doanh nghiệp đã trồng cây để thu hoạch rễ, chế biến thành một loại thực phẩm chức năng trà Hoàn Ngọc hỗ trợ phòng chống bệnh ung thư.
Rễ cây Ké hoa đào có khả năng ức chế enzyme α-glucosidase, chống oxy hóa và kháng khuẩn rất cao, có thể hướng đến việc sử dụng làm thảo dược đặc trị bệnh tiểu đường tuýp 2 mà ít tác dụng phụ. Việc chủ động tạo được nguồn nguyên liệu rễ bằng các kỹ thuật hiện đại sẽ cung cấp được nguồn nguyên liệu ổn định, không bị nhiễm dư lượng hóa chất (thuốc trừ sâu, hormone thực vật), nhằm ứng dụng trong điều trị tiểu đường tuýp 2 của rễ Ké hoa đào.
Quy trình và phương pháp thực hiện
Quy trình nuôi cấy tối ưu rễ tơ in vitro cây Ké hoa đào
* Sơ đồ quy trình:
* Thuyết minh quy trình:
Bước 1 (Thu hái): hạt Ké hoa đào (KHĐ) thu hái ngoài tự nhiên tại Thành phố Biên Hòa, Đồng Nai.
Bước 2 (Khử trùng): hạt KHĐ được rửa bằng ethanol 80% (v/v) trong 2 phút, sau đó chuyển qua rửa bằng NaClO 2% (g/L), rửa sạch 5 lần bằng nước cất vô trùng.
Bước 3 (Nuôi cấy cây con in vitro): hạt KHĐ được đặt trên môi trường MS (Murashige & Skoog): 3% sucrose, 8g/L agar, pH = 5,7.
Bước 4 (Nuôi cấy vi khuẩn): chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834 được hoạt hóa và tăng sinh trên môi trường Yeast mannitol medium (YMB) (pH = 7,0) cho tới khi đạt giá trị OD600 = 0,5.
Bước 5 (Xâm nhiễm): mẫu lá của cây con KHĐ 15 ngày tuổi (tính từ lúc hạt nảy mầm) được tạo vết thương và ngâm 10 phút trong dung dịch vi khuẩn (OD600 = 0,5).
Bước 6 (Đồng nuôi cấy): mẫu lá được chuyển sang trên môi trường Woody plant medium (WPM): 3% sucrose, 8g/L agar, pH = 5,7 trong 4 ngày.
Bước 7 (Loại vi khuẩn): mẫu lá được chuyển sang trên môi trường Woody plant medium (WPM): 3% sucrose, 8g/L agar, pH = 5,7 có bổ sung cefotaxime 250mg/L trong 20 ngày.
Bước 8 (Kiểm tra gen chuyển): rễ tơ giả định được kiểm tra sự hiện diện của gen rolB, rolC và virG.
Bước 9 (Nuôi cấy rễ tơ): rễ tơ được nuôi cấy trong erlen 250mL với mật độ nuôi cấy ban đầu (0,1g FW/30mL), trên môi trường WPM lỏng gấp đôi hàm lượng khoáng đa lượng, bổ sung 4% sucrose, 1μM Phenylalanine, pH = 5,7. Các erlen mang rễ được đặt trên máy lắc vòng (tốc độ 80 vòng/phút), nhiệt độ duy trì 22 – 25oC, trong điều kiện tối hoàn toàn.
Bước 10 (Thu hoạch rễ tơ): rễ tơ được thu nhận tại ngày nuôi cấy thứ 25.
Quy trình nuôi cấy tối ưu rễ tơ thủy canh cây Ké hoa đào
* Sơ đồ quy trình:
* Thuyết minh quy trình:
Bước 1 (Thu hái): hạt Ké hoa đào (KHĐ) thu hái ngoài tự nhiên tại Thành phố Biên Hòa, Đồng Nai.
Bước 2 (Gieo hạt): hạt KHĐ được gieo trên giá thể xơ dừa trong các thùng xốp (dài x rộng x cao: 60 x 40 x 50cm) được tưới phun sương mỗi ngày.
Bước 3 (Nuôi cấy vi khuẩn): chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834 được hoạt hóa và tăng sinh trên môi trường Yeast mannitol medium (YMB) (pH = 7,0) cho tới khi đạt giá trị OD600 = 0,5.
Bước 4 (Xâm nhiễm): cây con KHĐ 15 ngày tuổi (tính từ lúc hạt nảy mầm) được cắt bỏ rễ, tạo vết thương tại vị trí trụ hạ diệp và ngâm 10 phút trong dung dịch vi khuẩn (OD600 = 0,5).
Bước 5 (Đồng nuôi cấy): cây con được chuyển sang nuôi cấy trên hệ thống thủy canh tĩnh (môi trường WPM giảm 1/25 khoáng đa lượng, không bổ sung sucrose, vitamin) trong 5 ngày.
Cây Ké hoa đào được nuôi cấy bằng hệ thống thủy canh
Bước 6 (Loại vi khuẩn): cây con được ngâm và rửa sạch với nước có bổ sung cefotaxime 250 mg/L trong 30 phút.
Bước 7 (Kiểm tra gen chuyển): cây con mang rễ tơ giả định được kiểm tra sự hiện diện của gen rolB, rolC và virG.
Bước 8 (Nuôi cấy rễ tơ): cây con mang rễ tơ được nuôi cấy bằng hệ thống khí canh với mật độ nuôi cấy ban đầu (10 cây/thùng xốp chứa 20L môi trường 1/25 WPM). Hệ thống khí canh được thiết lập với 4 đầu phun sương/thùng xốp, vận tốc máy bơm 1,8L/phút, thời gian phun 30 giây/10 phút. Toàn bộ hệ thống được đặt trong nhà kính, nhiệt độ được duy trì 25 – 28oC bằng hệ thống làm mát tự động.
Bước 9 (Thu hoạch rễ tơ): cây KHĐ mang rễ tơ được thu nhận tại tuần nuôi cấy thứ 10.
Ưu điểm của công nghệ, tiềm năng ứng dụng
Quy trình đã ứng dụng thành công chiến lược tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy và bổ sung tiền chất để tăng tích lũy các nhóm hoạt chất có liên quan đến tăng hoạt tính ức chế α-glucosidase của rễ tơ Ké hoa đào. Đồng thời thu được sinh khối rễ tơ thủy canh có hoạt tính chính là điều trị tiểu đường tuýp 2 cao hơn so với chứng dương Arcarbose đang được sử dụng khá phổ biến trên thị trường.
Với sự thành công trong các kỹ thuật tạo rễ tơ, quy trình nuôi cấy rễ tơ Ké hoa đào giúp tạo ra nguồn rễ có hoạt tính cao hơn so với nguồn nguyên liệu thu hái ngoài tự nhiên, tạo nguồn nguyên liệu chủ động, ổn định. Sinh khối rễ tơ tạo thành đã được xây dựng các tiêu chuẩn chính cho nguồn rễ tơ thủy canh có hoạt tính điều trị tiểu đường tuýp 2 theo dược điển Việt Nam. Kết quả này mở ra hướng nghiên cứu mới về sản xuất rễ thực vật có hoạt tính sinh học cung cấp cho các công ty, xí nghiệp dược phẩm để làm nguyên liệu thu nhận dược chất tinh khiết.
Sinh khối rễ thủy canh cây Ké hoa đào được nuôi ở môi trường kết hợp các yếu tố đã được cải thiện
Sản phẩm rễ tơ thuỷ canh Ké hoa đào có thể sản xuất ở quy mô nhà lưới với các ưu điểm tăng trưởng nhanh, mang nhiều dược chất, đặc biệt là sạch và không nhiễm dư lượng hoá chất, ổn định về chất lượng, không phụ thuộc thời tiết, đất đai. Quy trình nuôi cấy rễ tơ Ké hoa đào có thể chuyển giao cho các nhà nuôi trồng dược liệu để cải tiến phương pháp thay cho trồng đất thường quy.
Hiện trên thế giới đã có một số công ty chuyên nuôi cấy rễ dược liệu công nghệ cao như Rootech của Thuỵ Điển, CBN Biotech của Hàn Quốc,... Tại Việt Nam, quy trình nuôi cấy rễ tơ Ké hoa đào nếu được ứng dụng ở các công ty nuôi cấy rễ dược liệu công nghệ cao sẽ mang lại nhiều lợi thế, nhất là đối với TP.HCM, một nơi không có nhiều ưu thế về nuôi trồng thực vật.
Hiện nay, Sàn Giao dịch Công nghệ Techport.vn (thuộc Trung tâm Thông tin và Thống kê Khoa học và Công nghệ – Sở KH&CN TP.HCM) đang tiếp tục đồng hành cùng nhóm nghiên cứu trong hoạt động hỗ trợ kết nối, tư vấn chuyển giao quy trình công nghệ, thiết bị cho doanh nghiệp, tổ chức hoặc các cá nhân có nhu cầu.
Thông tin chuyên gia, hỗ trợ
1. PGS.TS Quách Ngô Diễm Phương
Điện thoại: 0767011080
Email: qndphuong@hcmus.edu.vn
2. Trung tâm Thông tin và Thống kê Khoa học và Công nghệ - Phòng Giao dịch Công nghệ
Địa chỉ: 79 Trương Định, P. Bến Thành, Q.1, TP. HCM
Điện thoại: (028) 3822 1635 - Fax: (028) 3829 1957
Email: pgdcn@cesti.gov.vn
Lam Vân